Esami laboratorio: Esami genetici in Oncologia - Clonalità linfoide

Per la diagnosi e il monitoraggio del linfoma sono a disposizione dei test genetici di grande interesse.

È UN LINFOMA?
Non sono rari i casi in cui l’esame citologico non è in grado di fornire un grado adeguato di certezza, come in caso di estrema fragilità cellulare, ad esempio per l’effetto citolitico dei corticosteroidi prima del prelievo del campione. In questi casi si possono utilizzare i preparati citopatologici dai quali si sospetta la proliferazione linfomatosa e richiedere un test di clonalità linfoide. Il test di clonalità linfoide o PARR (PCR for Antigen Receptor Rearrangement) sfrutta la tecnica PCR per amplificare regioni del DNA che codificano per la porzione legante l’antigene della catena leggera delle immunoglobuline o del TCR (T-Cell Receptor) dei linfociti. Il riarrangiamento delle sequenze di queste regioni porterà le stesse ad essere differenti per lunghezza e sequenza di basi conferendo a ciascun linfocita, T o B, una caratteristica specificità antigenica. Di conseguenza, il test PARR per un campione di tessuto linfoide normale o reattivo fornirà come risultato una varietà di prodotti di amplificazione (policlonalità). Solitamente la trasformazione neoplastica di un linfocita e la proliferazione dei suoi cloni avviene dopo il riarrangiamento dei suoi recettori per cui, in caso di neoplasia linfoide, il test PARR fornirà come risultato una netta prevalenza di uno dei prodotti di amplificazione (monoclonalità).
Nel referto può anche essere indicato che esiste una oligoclonalità: n questo caso il significato clinico è maggiormente riferibile a una condizione reattiva piuttosto che neoplastica.

È possibile l’affinamento della diagnosi di linfoma tramite questo test?
Esistono due fenotipi, T o B. Il fenotipo è un fattore prognostico rilevante, considerando che, generalmente e con alcune eccezioni, i linfomi T si associano a una minore percentuale di risposta, ad una minore persistenza della remissione e alla sopravvivenza. Sebbene il riarrangiamento genetico dei linfociti sia solitamente associato alla linea cellulare B o T, linfociti B possono avere riarrangiamento dei loci dei linfociti T e, viceversa, linfociti T possono avere riarrangiamento dei loci dei linfociti B; questo fenomeno è detto riarrangiamento cross-lineage. Inoltre, anche le cellule mieloidi possono riarrangiare loci dei linfociti B o T. Per questo motivo, si sconsiglia l’assegnazione del fenotipo basato sul risultato del test di clonalità e si rimanda a indagini di immunofenotipizzazione (es. citofluorimetria o immunoistochimica).

La clonalità linfoide si può eseguire anche dopo una diagnosi dubbia di linfoma, ottenuta in ambito istopatologico. Prima di procedere vi consigliamo prima di contattare il Servizio di Istopatologia, per ricevere i consigli piu’ adeguati alla gestione del vostro caso. Ad esempio, le indagini di immunoistochimica, possono in molti casi, ad esempio nella maggior parte dei linfomi del gatto, essere sufficienti a distinguere un linfoma da una forma reattiva.

Vi invitiamo, se volete ricorredere alle indagini di clonalità linfoide, a considerare i tempi di refertazione, perche’ l’estrema complessita’ dell’indagine non permette diagnosi urgenti.

È POSSIBILE ESEGUIRE UN MONITORAGGIO DELLA CHEMIOTERAPIA ? È POSSIBILE INDIVIDUARE LA RECIDIVA DOPO CHEMIOTERAPIA PRIMA DELLA COMPARSA DEI SINTOMI ?
La ricerca della malattia minima residua (MMR) è una delle applicazioni più interessanti ed innovative della genetica in ambito oncologico. In particolare, nel caso del linfoma è possibile individuare nel sangue periferico la ricomparsa del clone neoplastico prima della recidiva clinica (ad esempio prima della ricomparsa di linfoadenomegalia). L’iter prevede come primo step l’analisi di clonalità “tradizionale” con primer per regioni consenso, al momento della diagnosi. Quindi, se si identifica il riarrangiamento clonale si procede con il sequenziamento e il disegno di primer definiti paziente-specifici che amplificano solo il clone in questione. Se si vuole utilizzare la genetica per la valutazione della MMR è necessario richiedere il sequenziamento e il disegno dei primer pazienti-specifici su campioni ottenuti prima di iniziare la chemioterapia. In corso di monitoraggio si eseguirà la ricerca del solo clone, individuato e conservato nella banca dati. Si dovrà informare il Laboratorio che si sta eseguendo un monitoraggio di un paziente precedentemente già studiato. Importante: (al momento) il monitoraggio si puo’ eseguire esclusivamente nei linfomi B

I TEST DI CLONALITÀ LINFOIDE SONO SEMPRE CORRETTI E DEFINITIVI?
Al pari di qualsiasi altra indagine diagnostica, non possiamo attribuire una sensibilità e specificita’ del 100% alle prove di clonalità linfoide. Inoltre, essendo una tecnica di recente scoperta esiste senz’altro un margine di miglioramento e ottimizzazione. In linea generale potremmo associare ai test genetici una sensibilità del 70-90% (si intende la capacità del test di individuare i casi di linfoma) e una specificità del 95% (si intende la capacità di escludere il linfoma nel campione testato). 

PERCHÈ SI OSSERVANO DEI FALSI NEGATIVI [il test fornisce un quadro di policlonalità, mentre il paziente è affetto da un linfoma]?
-I set di primer ad oggi disponibili non possono coprire tutti i riarrangiamenti che si possono verificare nei linfomi.
– Esistono delle ipermutazioni somatiche in geni già riarrangiati di alcuni linfomi B.

PERCHE’ SI OSSERVANO DEI FALSI POSITIVI?
– Utilizzo del gene per la catena gamma del recettore dei linfociti T (TCRG), che presentano minore diversità giunzionale. Per ovviare a questo problema si devono utilizzare tecniche al elevata risoluzione quali: single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP), denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), heteroduplex analysis (HDA) e gene scanning technolologies
– Fenomeni di pseudoclonalità. Solitamente si osservano in caso di DNA di scarsa qualità o di DNA con un template limitato. Infine, è stata descritta anche la possibilità che l’eosina presente nei campioni istopatologici possa determinare un picco clonale
– Infezioni croniche (es. ehrlichiosi).

In conclusione, allo stato attuale delle conoscenze, la valutazione della clonalità linfoide presenta ancora delle limitazioni per essere considerato un test conclusivo per la diagnosi di neoplasia linfoide; pertanto, i risultati devono essere interpretati contestualmente a reperti clinici, morfologici e immunofenotipici.

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