La citometria a flusso è una metodica che permette di studiare delle cellule contenute in una sospensione (sangue, midollo osseo, aspirato linfonodale, liquido di versamento…).

Le cellule, colpite dalla luce di un laser, vengono raggruppate a seconda delle caratteristiche di diffrazione della luce e dall’eventuale legame con un anticorpo marcato.

Attualmente la citometria a flusso trova in ambito veterinario e specificatamente al Laboratorio San Marco le seguenti applicazioni:

  • ricerca anticorpi anti eritrociti e anti piastrine per la diagnosi di anemia emolitiche e trombocitopenie immunomediate (vedi sezione immunologia)
  • analisi CD4/CD8
  • fenotipizzazione di linfomi e leucemie
  • stadiazione di pazienti affetti da malattie oncoematologiche

Nell’ambito della fenotipizzazione (B/T) dei linfomi il Laboratorio fornisce due diversi esami. Entrambi gli esami vanno eseguito a seguito di diagnosi morfologica di linfoma, ovvero dopo una diagnosi citopatologica o citochimica realizzata dal Laboratorio San Marco. Se la diagnosi non è stata eseguita dal Laboratorio San Marco, si chiede cortesemente di contattare il Laboratorio prima dell’invio. Gli esami disponibili, dopo la diagnosi di linfoma, per definire il fenotipo sono:

  • Immunocitochimica
  • Immunofenotipo linfonodale mediante metodica citofluorimetrica

IMMUNOCITOCHIMICA: Per la tipizzazione del linfoma l’immunocitochimica utilizza 2 anticorpi (CD3, CD79, rispettivamente marcatori della linea T e B). Va eseguita su almeno 3 vetrini, meglio 5, da inviare NON colorati, e allestiti dalla STESSA SEDE LINFONODALE. Per l’allestimento dei vetrini è consigliata l’agoinfissione (non aspirazione).  L’esame imunocitochimico deve essere sempre associato ad un esame citologico dei distretti clinicamente sospetti, con richiesta separata (esame citologico, che verrà conteggiato a parte).
Si ricorda che la diagnosi di linfoma nel cane trattandosi di una neoplasia multicentrica prevede il campionamento di più sedi linfonodali/organomegalie.

IMMUNOFENOTIPO LINFONODALE: La citofluorimetria a flusso, che ad oggi la rappresenta il gold standard per la fenotipizzazione dei linfomi, utilizza un pannello più esteso di anticorpi. Oltre ai marcatori T e B permette di studiare il fenotipo delle sottopopolazioni linfocitarie (CD4/CD8) e identificare eventuali fenotipi aberranti o indicativi di specifiche varianti di linfomi (T zone linfoma, J Vet Intern Med 2014 May-Jun;28(3):878-86). 

Per l’allestimento si deve preventivamente richiedere delle provette per l’immunofenotipo linfonodale al laboratorio (area riservata: “richiedi kit e materiali”). Le provette contengono all’interno un terreno di trasporto in grado di preservare le cellule e evitare eventuali proliferazioni batteriche. Le provette sono stabili per 1 mese se conservate a temperatura di refrigerazione.

Per l’allestimento si consiglia di eseguire l’agoinfissione di più linfonodi e dispensare quanto raccolto nel terreno di trasporto apposito (1 linfonodo per ciascuna provetta, almeno 3). Spedire al laboratorio entro 24h dal prelievo. Si rammenta che se non diversamente specificato tutti gli allestimenti saranno convogliati in un’unica provetta al fine di ricavare un pellet di cellule su cui eseguire l’immunofenotipo. Sarà cura del laboratorio verificare mediate citocentrifugazione la qualità e la quantità delle cellule vitali presenti.

È possibile inviare contestualmente all’immunofenotipo linfonodale dei vetrini per eseguire l’immunocitochimica in caso di preparato non idoneo alla citometria. I vetrini verranno destinati all’immunocitochimica se saranno rispettate le indicazioni previste (vedi vetrini allestiti dalla medesima sede linfonodale).

Il referto dell’immunofenotipo linfonodale potrà essere espresso come prevalenza di un particolare fenotipo o, in caso di diagnosi morfologica di linfoma eseguita presso il Laboratorio San Marco come linfoma B/T.  Eventuali interpretazioni aggiuntive saranno formulate a fronte di quadri fenotipici “particolari”.

LA FENOTIPIZZAZIONE CELLULARE NELL’AMBITO DELL’ONCOEMATOLOGIA DOVREBBE ESSERE SEMPRE OPPORTUNAMENTE SUPPORTATA DALLA CONTESTUALE VALUTAZIONE CITOLOGICA.

Nel caso di immunofenotipo splenico o di organi particolarmente vascolarizzati è opportuno miscelare il terreno di trasporto con del K3EDTA, nella misura in cui il terreno non è dotato di potere anticoagulate: si consiglia di dispensare due provette di terreno di trasporto in una provetta contenente k3EDTA e allestire l’immunofenotipo come sopra.

L’immunocitochimica trova applicazione anche in altre patologie neoplastiche: parimenti alla citometrica non può prescindere da una valutazione morfologica. La scelta del pannello anticorpale da utilizzare è infatti in funzione del sospetto diagnostico formulate in corso di esame citologico.

Il reparto di patologia è disponibile a fornire eventuali chiarimenti.